新しい CRISPR ベースのツールは、欠陥のある遺伝子を切り取り、新しい遺伝子に置き換えることができます



CRISPR 遺伝子編集システムに基づいて、MIT の研究者は、より安全で効率的な方法で、欠陥のある遺伝子を切り取り、新しい遺伝子に置き換えることができる新しいツールを設計しました。

このシステムを使用して、研究者は、36,000 DNA 塩基対の長さの遺伝子を、数種類のヒト細胞やマウスの肝細胞に送達できることを示しました。 PASTE として知られるこの新しい技術は、嚢胞性線維症など、多数の変異を伴う欠損遺伝子によって引き起こされる疾患の治療に有望である可能性があります。

これは、これらの本当に治療が難しい病気を潜在的に標的とする新しい遺伝的方法です. 私たちは、個々の突然変異を修正するだけでなく、遺伝子を置き換えるという、当初の遺伝子治療の目的に向けて取り組みたかったのです。」


Omar Abudayyeh、マサチューセッツ工科大学マクガバン脳研究所のマクガバン フェロー

新しいツールは、CRISPR-Cas9 の正確なターゲティングを組み合わせます。CRISPR-Cas9 は、もともと細菌防御システムに由来する一連の分子であり、ウイルスが自身の遺伝物質を細菌ゲノムに挿入するために使用するインテグラーゼと呼ばれる酵素です。

「CRISPR と同じように、これらのインテグラーゼは、細菌とそれらに感染するウイルスとの間で進行中の戦いから生じます」と、同じく McGovern Fellow である Jonathan Gootenberg は述べています。 「これは、これらの自然のシステムから、興味深い有用な新しいツールを豊富に見つけ続ける方法を物語っています。」

Gootenberg と Abudayyeh は、本日 Nature Biotechnology に掲載された新しい研究の上級著者です。 この研究の筆頭著者は、MIT テクニカル アソシエイトの Matthew Yarnall と Rohan Krajeski、元 MIT 大学院生の Eleonora Ioannidi、MIT 大学院生の Cian Schmitt-Ulms です。

DNA挿入

CRISPR-Cas9 遺伝子編集システムは、Cas9 と呼ばれる DNA 切断酵素と、その酵素をゲノムの特定説(推定)の領域に誘導する短い RNA 鎖で構成され、Cas9 にどこを切断するかを指示します。 Cas9 と疾患遺伝子を標的とするガイド RNA が細胞に送達されると、ゲノムに特定説(推定)の切断が行われ、細胞の DNA 修復プロセスによって切断が接着され、多くの場合、ゲノムのごく一部が削除されます。

DNAテンプレートも提供される場合、細胞は修復プロセス中に修正されたコピーをゲノムに組み込むことができます. ただし、このプロセスでは細胞が DNA の二本鎖切断を行う必要があり、細胞に有害な染色体の欠失や再編成を引き起こす可能性があります。 別の制限は、非分裂細胞にはアクティブな DNA 修復プロセスがないため、分裂している細胞でのみ機能することです。

MIT のチームは、二本鎖 DNA の切断を誘発することなく、欠陥のある遺伝子を切り取り、新しい遺伝子に置き換えることができるツールを開発したいと考えていました。 この目標を達成するために、彼らはバクテリオファージと呼ばれるウイルスが自分自身を細菌ゲノムに挿入するために使用するインテグラーゼと呼ばれる酵素のファミリーに注目しました。

この研究では、研究者は、50,000 塩基対もの巨大な DNA チャンクを挿入できるセリン インテグラーゼに注目しました。 これらの酵素は、「着陸パッド」として機能する付着部位として知られる特定説(推定)のゲノム配列を標的とします。 宿主ゲノムに正しいランディング パッドを見つけると、それに結合して DNA ペイロードを統合します。

過去の研究で科学者たちは、着陸パッドが非常に特異的であり、他の部位を標的とするようにインテグラーゼを再プログラムすることが困難であるため、人間の治療のためにこれらの酵素を開発することは困難であることに気付きました. MIT チームは、これらの酵素を正しいランディング サイトに挿入する CRISPR-Cas9 システムと組み合わせることで、強力な挿入システムの簡単な再プログラミングが可能になることに気付きました。

新しいツールである PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements) には、特定説(推定)のゲノム部位を切断する Cas9 酵素が含まれており、その部位に結合する RNA 鎖によって誘導されます。 これにより、46 の DNA 塩基対を含むランディング サイトを挿入するために、ゲノム内の任意のサイトをターゲットにすることができます。 この挿入は、最初に融合逆転写酵素を介して 1 本の DNA 鎖を追加し、次にその相補鎖を追加することにより、二本鎖切断を導入することなく行うことができます。

着陸部位が組み込まれると、インテグラーゼがやって来て、はるかに大きな DNA ペイロードをその部位のゲノムに挿入することができます。

「これはプログラム可能な DNA 挿入という夢の実現に向けた大きな一歩だと考えています」と Gootenberg 氏は述べています。 「これは、統合したいサイトと貨物の両方に合わせて簡単に調整できる手法です。」

遺伝子置換

この研究では、研究者は、PASTE を使用して、肝細胞、T 細胞、リンパ芽球 (未熟な白血球) など、いくつかのタイプのヒト細胞に遺伝子を挿入できることを示しました。 彼らは、治療に役立つ可能性のある遺伝子を含む 13 の異なるペイロード遺伝子を使用して送達システムをテストし、それらをゲノムの 9 つの異なる位置に挿入することができました。

これらの細胞に、研究者は 5 ~ 60% の成功率で遺伝子を挿入することができました。 このアプローチはまた、遺伝子統合部位での不要な「インデル」(挿入または削除) をほとんど生成しませんでした。

「インデルはほとんど見られず、二本鎖切断を行っていないため、染色体の再編成や大規模な染色体アームの欠失について心配する必要はありません」と Abudayyeh 氏は言います。

研究者はまた、マウスの「ヒト化」肝臓に遺伝子を挿入できることも実証しました。 これらのマウスの肝臓は、約 70% のヒト肝細胞で構成されており、PASTE はこれらの細胞の約 2.5% に新しい遺伝子を組み込むことに成功しました。

研究者がこの研究で挿入した DNA 配列は、最大 36,000 塩基対の長さでしたが、さらに長い配列も使用できると考えています。 ヒトの遺伝子は、数百から 200 万以上の塩基対に及ぶことがありますが、治療目的で使用する必要があるのはタンパク質のコード配列のみであり、ゲノムに挿入する必要がある DNA セグメントのサイズを大幅に縮小します。

研究者は現在、欠陥のある嚢胞性線維症遺伝子を置き換える可能な方法として、このツールを使用する可能性をさらに調査しています. この技術は、血友病やG6PD欠乏症などの欠陥遺伝子によって引き起こされる血液疾患、または遺伝子反復が多すぎる欠陥遺伝子によって引き起こされる神経障害であるハンチントン病の治療にも役立つ可能性があります.

研究者はまた、他の科学者が使用できるように、自分たちの遺伝子構築物をオンラインで利用できるようにしました。

「これらの分子技術を設計することの素晴らしい点の 1 つは、人々がそれらの上に構築し、開発し、おそらく私たちが考えもしなかった、または考えもしなかった方法でそれらを適用できることです」と Gootenberg 氏は言います。 「その新興コミュニティの一員であることは本当に素晴らしいことです。」

この研究は、スイス国立科学財団ポスドク モビリティ フェローシップ、国立衛生研究所、マクガバン研究所ニューロテクノロジー プログラム、K. リサ ヤンおよびホック E. タン神経科学分子治療センター、G. ハロルドおよびレイラ Y によって資金提供されました。 . Mathers Charitable Foundation、MIT John W. Jarve Seed Fund for Science Innovation、Impetus Grants、Cystic Fibrosis Foundation Pioneer Grants、Google Ventures、Fast Grants、McGovern Institute。

ソース:

マサチューセッツ工科大学

ジャーナルの参照:

Yarnall、MTN、他。 (2022) CRISPR 指向のインテグラーゼを使用した、二本鎖 DNA 切断のない大きな配列のドラッグ アンド ドロップ ゲノム挿入。 ネイチャーバイオテクノロジー。 doi.org/10.1038/s41587-022-01527-4.



Source link