バクテリオファージの合成工学の探求

Study: Synthetic engineering and biological containment of bacteriophages. Image Credit: MattLphotography/Shutterstock


米国科学アカデミー紀要に掲載された最近の研究で、研究者は生物学的バクテリオファージの封じ込めと合成工学を実証しました。

研究:バクテリオファージの合成工学と生物学的封じ込め。 画像著作権: MattLphotography/Shutterstock

薬剤耐性菌疾患と合成生物学の最近の進歩によってもたらされる深刻な危険性により、治療の可能性を秘めた遺伝子組み換えファージに大きな注目が集まっています。 これまでのところ、改変されたファージに関する多数の研究は、概念実証 (POC) または比較的短いゲノムを持つファージまたは「ファージディスプレイキット」を利用した基礎研究に限定されています。 また、実用化に向けた効果的な翻訳を確保するための予防措置も講じられていません。

研究について

本研究は、無細胞ファージ エンジニアリングと再起動のためのプラットフォームを作成しました。

まず、チームは、in vitro で組み立てられたゲノムを使用して、グラム陰性菌と抗酸マイコバクテリアに感染したいくつかの野生型 (WT) ファージを再起動しようとしました。 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を使用して、化学的に生成されたデオキシリボ核酸 (DNA) またはテンプレート ファージ ゲノムから得られた完全に組み立てられたファージ ゲノムを増幅しました。 プライマーは、すべての隣接する PCR フラグメントで 28 bp から 65 bp の相同領域を生成するために開発されました。 これらの断片は組み立てられ、細菌宿主にエレクトロポレーションされ、ファージの再活性化をもたらしました。

チームは、環状ゲノムに由来するファージを再起動する末端結合を可能にするフラグメントを開発しました。 コリファージ ラムダは、S. Typhimurium LT2 に存在する 4 つのフラグメントと共に、Salmonella ファージ P22 および E. coli の 5 つのフラグメントから効果的に再活性化されました。 抗酸マイコバクテリウム種に感染し、グアニン-シトシンゲノムが高いモデルマイコファージD29も再起動されました。 環状ゲノムを作成するために、5 つの DNA 断片が生成されました。

結果

線形ゲノムを持つモデル コリファージ T7 は、複製時に線形コンカテマー化を示し、研究戦略の評価に使用されました。 線形ゲノムは 4 つの PCR フラグメントから構築され、大腸菌にエレクトロポレーションされてファージ T7 が再活性化されました。 コリファージ T3、シュードモナス ファージ gh-1、およびサルモネラ ファージ SP6 は、T7 に匹敵するゲノム構造とライフ サイクルを持つことが予測されました。 チームはまた、大腸菌の DNA 断片から T3 を、ネズミチフス菌 LT2 の DNA 断片から SP6 を、シュードモナス プチダの DNA 断片から gh-1 を再生することに成功しました。 これらの結果は、研究デザインのガイドラインと方法論が、組み立てられた線形ゲノムからファージを再起動するのに効果的であることを示しました。

機能的なマイコファージ D29、特徴付けられていないマイコファージ B1、および GS4E は、スメグマ菌 mc2 155 から再起動されました。マイコファージ TM4 は、公開されている配列データに基づいて、化学的に生成された 6 つの DNA セグメントから構築されました。 DNA 断片を増幅し、隣接部分との 28 bp から 38 bp のオーバーラップを示し、精製し、in vitro で環状化しました。 ゲノムは、M. smegmatis mc2 155 に導入されました。そのゲノムが化学的に生成された、機能する合成 TM4 が再起動されました。 合成 TM4 ゲノム全体が MiSeq によって配列決定され、参照された TM4 と 100% 同一であることが証明されました。これは、配列データからのファージの再起動が効果的であることを示しています。

よく特徴付けられたファージ T7 は、POC 調査のモデルとして選択されました。 T7 機構は、そのゲノムを T7 ヘッド粒子に「パッケージ化」または「保存」するためのパッケージング シグナル シーケンス (Pac) を特定説(推定)しました。 Pacは、PacBおよびPacCを含む。 ターミナーゼ小サブユニット gp18 は、ファージ ヘッドへの DNA 転座のために、サブユニット gp19-プロヘッド複合体と結合します。 ヘッドフル パッケージングの後、チームは、gp19 がコンカテマー T7 ファージ ゲノムの PacC で切断され、T7 ヘッドの成熟につながることに注目しました。

次に、Pac と「お気に入りの遺伝子」(yfg) を含むプラスミドを作成し、大腸菌に注入しました。 プラスミドを含む大腸菌細胞へのゲノムのエレクトロポレーションにより、T7 (T7Pac) に基づく合成形質導入粒子が生成されました。 細胞内で、Pac を含まないゲノムは、Pac を含むプラスミドを頭部粒子にパッケージングする前に子孫ビリオンを生成し、T7Pac-yfg を生成しました。 この方法を使用して、チームはlacZを含むプラスミドであるT7Pac-lacZを合成しました。 ライセートをlacZ欠損大腸菌と混合し、続いてLB X-galプレートにプレーティングした。 したがって、1.6×104 CFU/mL の T7Pac-lacZ が生成され、形成されたすべてのコロニーは青色でした。 細菌の芝生では、T7Pac-lacZ はプラークを発達させず、生物学的な封じ込めが示唆されました。

チームは、カプシドタンパク質をコードする遺伝子 31 を除いた SP6 ファージ ゲノムを構築しました。ゲノムは、遺伝子 31 を発現する S. Typhimurium の LT2 株に導入されました。PCR を使用して、合成 SP6Δhead からの遺伝子 31 の欠失が確認されました。 得られた高力価 SP6Δhead ライセートは、遺伝子 31 を発現する LT2 のローン上にプラークを発達させましたが、これは親 LT2 には存在しませんでした。

全体として、この研究結果は、インビトロゲノムアセンブリを介してグラム陰性菌および抗酸マイコバクテリアに感染する、天然および人工ファージの生成を実証しました。



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