COVID-19 による内皮機能障害を再現するための 3 次元 in vitro モデル

Study: SARS-CoV-2 spike protein induces endothelial dysfunction in 3D engineered vascular networks. Image Credit: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock


bioRxiv* プレプリント サーバーに投稿された最近の研究では、研究者は血管内皮細胞に対する重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) の影響を評価するために、3 次元 (3D) の in vitro 組織モデルを開発しました。

研究: SARS-CoV-2 スパイクタンパク質は、3D 操作された血管ネットワークで内皮機能障害を誘発します。 画像著作権: PHOTOCREO Michal Bednarek/Shutterstock

コロナウイルス病 2019 (COVID-19) の病原性の理解を深めるためには、in vitro モデルが必要です。 以前は、SARS-CoV-2 感染の内皮への影響を研究するための in vitro 二次元 (2D) 組織モデルが開発されており、内皮細胞における細胞接着分子発現の減少、内皮バリアの破壊、および炎症性サイトカイン分泌の増強が行われていました。 ただし、血管ネットワークをシミュレートできないため、2D モデルは 3D モデルほど正確に生体内の状態をモデル化できません。

本研究の著者は以前、血管新生を評価するために、内皮前駆細胞 (EP) に分化し、コラーゲン ヒドロゲル構造内にカプセル化されたヒト誘導多能性幹細胞 (hiPSC) を使用しました。

研究について

今回の研究では、研究者は、COVID-19 における血管網の破壊を研究するために 3D モデルを作成することで、以前の分析を拡張しました。

分析のために、ヒト皮膚包皮線維芽細胞 (DF19-19-9-11T) に由来する hiPSC を培養し、hiPSC-EP に分化させました。 続いて、分化クラスター (CD)34+ hiPSC-EP を FACS (蛍光活性化セルソーティング) 分析によって分離し、CD34+ hiPSC-EP 細胞をコラーゲンヒドロゲル構造にカプセル化しました。

カプセル化されたハイドロゲルを 1 週間培養して、毛細血管網を形成しました。 カプセル化の 5 日後、CD34+-hiPSC-EP を含んだコラーゲン ヒドロゲルは、SARS-CoV-2 感染をシミュレートするために、SARS-CoV-2 スパイク (S) タンパク質 (CSP) 処理されました。 CSP処置後の炎症性サイトカイン発現を測定するために、サイトカイン放出アッセイを実施した。 CD34 + iPSC-EP を含むコラーゲン ヒドロゲル内で生成された容器のようなネットワークは、免疫細胞化学によって視覚化されました。

細胞もデキサメタゾンで処理し、共焦点顕微鏡で可視化しました。 血管の長さ、血管接続、および血管内腔の直径は、以前に開発された計算パイプラインに基づいて分析されました。 ハイドロゲルからの SARS-CoV-2 メッセンジャー リボ核酸 (mRNA) を qRT-PCR (定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) 分析にかけ、サイクル閾値 (Ct) 値に基づいて mRNA 発現を定量化しました。

さらに、チームは、コラーゲン ハイドロゲル内で血管ネットワークを形成する CD34+-hiPSC がアンギオテンシン変換酵素 2 (ACE2) を発現しているかどうかを調べました。 さらに、KDR (キナーゼ挿入ドメイン受容体)、CD31、CDH5 (カドヘリン 5)、および CD34 などのいくつかの内皮遺伝子の発現を評価して、1 週間の培養期間にわたる内皮成熟を追跡し、レベルを ACE2 発現に関連付けました。

結果

CSP による治療は、コラーゲン ハイドロゲルにカプセル化された hiPSC 由来の EP における血管形成細胞の割合と血管ネットワーク接続を大幅に減少させました。 炎症性サイトカイン発現の上昇が臨床所見に従って観察され、17 ng/mL デキサメタゾン処理は CSP 処理細胞の血管機能障害を軽減しました。 免疫細胞が存在しない場合でも、チームは 3D in vitro 血管新生モデルを使用して、COVID-19 の臨床症状を代表する内皮細胞の SARS-CoV-2 感染による機能障害をシミュレートできました。

CSP 治療後、血管網の密度が低下し、丸みを帯びた形態が変化した細胞が増えました。 CSP 処理 (10 μg/mL) により、血管エンドポイント、血管分岐点、血管リンクがそれぞれ 22%、33%、29% 減少しました。 100 µg/mL 濃度の CSP を使用した場合に観察された対応する減少は、それぞれ 17%、24%、および 22% でした。

血管ネットワーク接続の損失は、CSP 処理コラーゲン ヒドロゲル間で観察され、最大の血管ネットワークの一部であった細胞の割合が 77% 減少しました。 CSP を 1 日目に添加すると、血管の分岐点と血管を形成する細胞を含むコラーゲン ハイドロゲルの体積分率でそれぞれ 19% と 31% の減少が観察されました。 CSP を 5 日目に追加した場合に観察された対応する減少は、それぞれ 59% と 66% であり、血管網が形成され始めてから 5 日目に追加した場合に CSP 毒性が高いことを示しています。

ACE2 発現は 0 日目に最も高く、CSP 治療後 1 週間以内に 62% 減少しました。 チームは、CD34 発現が 1 日目と 5 日目にそれぞれ 2.7 倍と 6.7 倍減少したことを観察しました。 対照的に、CD31 の発現は 1 日目、5 日目、7 日目にそれぞれ 2 倍、4 倍、7 倍に増加し、CDH5 の発現は 5 日目と 7 日目にそれぞれ 2 倍と 3 倍に増加しました。

CSP 処理により、インターロイキン 8 (IL-8) およびケモカイン CXC モチーフ リガンド 1 (CXCL1) の放出が、それぞれ 2 倍および 3 倍に大幅に増加しました。 両方のサイトカインは内皮細胞によって産生され、COVID-19 でアップレギュレートされます。 この調査結果は、CSP 治療が重度の COVID-19 症例で記録されているサイトカインストームに匹敵する炎症状態を引き起こしたことを示しています。

全体として、研究結果は、CSP処理されたhiPSC-EPを含むコラーゲンヒドロゲルを使用して、臨床現場で観察されたCOVID-19誘発性の内皮機能障害の再現に成功したことを示しました。 CSP 治療は、デキサメタゾンによって阻害された血管網細胞および血管網接続性に関して、有意な血管破壊を引き起こしました。

*重要なお知らせ

medRxiv は、査読されていない暫定的な科学レポートを公開しているため、決定的なものと見なしたり、臨床診療/健康関連の行動をガイドしたり、確立された情報として扱ったりするべきではありません。



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