SARS-CoV-2 用に開発された自己増幅型ウイルス RNA ワクチンの重要な生物物理学的特性

Study: Biophysical characterisation of the structure of a SARS-CoV-2 self-amplifying - RNA (saRNA) vaccine. Image Credit: Andreas Prott/Shutterstock


bioRxiv* プレプリント サーバーに投稿された最近の研究では、研究者はさまざまな分析特性評価技術を使用して、インペリアル カレッジ ロンドン自己増幅型ウイルス リボ核酸 (RNA) ワクチン (IMP-1) の生物物理学的属性を決定しました。 2 (SARS-CoV-2)。

研究: SARS-CoV-2 自己増幅 – RNA (saRNA) ワクチンの構造の生物物理学的特徴付け。 画像著作権: Andreas Prott/Shutterstock

バックグラウンド

2019 年後半にコロナウイルス病 2019 (COVID-19) のパンデミックが発生して以来、ワクチン技術、特にメッセンジャー RNA ワクチンの開発は、SARS-CoV-2 感染の重症度と伝染を緩和するために大幅に進歩しました。

自己増幅型 (sa) RNA ワクチンは、mRNA ワクチンよりも優れています。自己増幅型レプリコンにより、宿主細胞機構が標的抗原 RNA の複数のコピーを作成できるようになるからです。 これにより、10 倍から 100 倍の低用量のワクチンを投与できるという利点が得られますが、自己増幅コードにより、ワクチンは通常の mRNA ワクチンよりもかさばります。

RNA ワクチンの利点は、設計、製造、または変更が容易であることにあります。 mRNA ワクチンの製造プロセスには、RNA 分子の in vitro 転写から始まり、精製および脂質ナノ粒子へのカプセル化に至るまで、さまざまなステップが含まれます。 プロセスの各ステップには、さまざまな試薬と複数のサブプロセスが含まれており、これらのいずれかのわずかなエラーでも、効果のない、または不完全なワクチンが作成される可能性があります。

したがって、分析的特性評価と品質管理は、効果的な mRNA ワクチンを製造するために不可欠です。

研究について

本研究では、研究者は紫外 (UV) 分光法、生物学的小角散乱 (BioSAXS)、動的光散乱 (DLS)、および円二色性 (CD) を使用して、IMP-1 の生物物理学的属性を特徴付けました。 この saRNA ワクチンは、融合前に安定化された SARS-CoV-2 スパイクタンパク質の遺伝子コードと、ベネズエラ馬脳炎ウイルス (VEEV) レプリカーゼで構成されています。

IMP-1 mRNA は in vitro で転写され、精製され、タンジェンシャル フローろ過とクロマトグラフィーを使用して濃縮されました。 IMP-1 mRNAの純度と濃度は、A260/280 UV分光法アッセイを使用して評価されました。 260 nm と 280 nm の吸光度の比率は、RNA の純度を決定するために使用され、2 未満の比率はタンパク質の混入を示します。

次に、研究者は、溶液ベースの光散乱技術であるDLSを実行して、クエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム緩衝液中のRNA分子の多分散性とサイズを決定しました。 クエン酸ナトリウム中のIMP-1 RNAもBioSAXS実験で使用して、RNAのサイズと形状を決定しました。 BioSAXS は、非常に少量の精製サンプルを必要とするハイスループット プロセスであり、オフラインの家庭用 X 線またはシンクロトロン施設を使用して実行できます。

最後に、リン酸ナトリウム緩衝液および水中で RNA に対して CD を実行し、RNA 分子の構造およびキラリティーまたはコンホメーションを理解しました。 CDスペクトルは、320nmから180nmの波長範囲を使用する分光光度計を使用して測定した。

結果

結果は、IMP-1 RNA分子が11,551塩基対を含み、重量が3.71MDaであることを示した。 UV 分光法による A260/280 比は 2.18 であり、RNA にタンパク質の夾雑物が含まれていないことを示しています。

DLS および BioSAXS 実験により、RNA 分子の直径は 873.63 Å であると決定されました。 DLS メソッドは 2 つの異なるバッファーで実行され、RNA の Z 平均直径と多分散指数 (PDI) は、両方のバッファーでわずかではあるが有意に異なり、バッファーの種類、イオン強度、および pH が RNA のサイズに影響を与えることを示しています。

RNA 分子の構造とコンフォメーションの特徴を明らかにする CD スペクトルは、IMP-1 RNA 分子における右側の A 型 RNA ヘリックスとスタッキング相互作用を示しました。 水を使用した測定からのスペクトルは、DLS と同様に、CD の結果がバッファーに依存していることを示す、より小さいヘリカル シグナルを明らかにしました。 分析手法として、CD は RNA の構造とコンフォメーションに対するバッファー、pH、温度、変性剤、および塩の影響を観察するのに非常に役立ちます。

著者らはまた、負に荷電した mRNA 分子を送達し、脂質ナノ粒子カプセル化を使用してワクチンを安定させ、効果的に送達する際の課題についても説明しました。

結論

要約すると、この研究では、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質と VEEV レプリカーゼの遺伝コードを保持するプラスミドから転写された IMP-1 mRNA 分子の純度、サイズ、多分散性、構造、およびコンフォメーションを研究するために、さまざまな分析特性評価手法を調査しました。 .

この研究で調査された UV 分光法、DLS、BioSAXS、および CD 技術は、RNA 分子の濃度、サイズ、形状、および構造に関する貴重な情報を提供しました。 この研究では、バッファー、pH、およびイオン強度が RNA の構造に及ぼす影響も明らかになりました。 著者らは、示差走査熱量測定や小角中性子散乱などの追加の技術により、関連する生理学的温度での RNA 分子の熱力学、安定性、および構造をよりよく理解できると考えています。

*重要なお知らせ

bioRxiv は、査読されていない暫定的な科学レポートを発行しているため、決定的なものと見なしたり、臨床診療/健康関連の行動をガイドしたり、確立された情報として扱ったりするべきではありません。



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