ナノモルの中和効果を持つ単純なペプチドによってブロックされたすべての SARS-CoV-2 バリアント

Study: Nanomolar inhibition of SARS-CoV-2 infection by an unmodified peptide targeting the prehairpin intermediate of the spike protein. Image Credit: Kateryna Kon / Shutterstock


ジャーナル PNAS に掲載された最近の研究で、フィンランドと米国の研究者は、化学修飾なしで重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) を阻害する新しいヘプタッド リピート 2 (HR2) ペプチドを報告しました。

研究: スパイクタンパク質のプレヘアピン中間体を標的とする未修飾ペプチドによる SARS-CoV-2 感染のナノモル阻害。 画像著作権: Kateryna Kon / Shutterstock

バックグラウンド

SARS-CoV-2 は、そのスパイク (S) 糖タンパク質の受容体結合ドメイン (RBD) に変異を保有するすべてのバリアント オブ コンサーン (VOC) で継続的に進化しており、すべてのコロナウイルス病 2019 (COVID-19) ワクチンとモノクローナル抗体 ( mAb) 療法は無効です。

SARS-CoV-2 に対するより効果的な抗ウイルス剤、特に構造を標的とし、変異の影響を受けにくい処理を施したもの (例: SARS-CoV-2 の 7 反復 1 および 2 (HR1-HR2) 6 ヘリックス バンドル) が緊急に必要とされています。 S)。

以前、研究者はいくつかの構造工学的アプローチを使用して、SARS-CoV-2 S 残基 1168 ~ 1203 の 36 アミノ酸セグメントに基づいて、より効果的な HR2 ベースの阻害剤を作成しました。

研究について

本研究では、研究者は、longHR2_42 と呼ばれる S 残基 1162 ~ 1203 にまたがる未修飾の SARS-CoV-2 HR2 ペプチドが、以前のすべての試みと比較して SARS-CoV-2 阻害特性が大幅に改善されていることを発見しました。 彼らは、HR1 に結合した longHR2_45 の高解像度クライオ電子顕微鏡 (cryo-EM) 構造を決定するために、分子足場法を使用して HR1-HR2 バンドルを特徴付けました。

次に、Coot を使用して、アミノ酸残基 1159 ~ 1179 にまたがるより長い N 末端領域を持つ拡張 HR2 ペプチドを設計し、ナノモル (nM) 範囲で SARS-CoV-2 阻害を達成しました。 彼らは、自動化された構造改良プロトコルを使用して、Rosetta で構造を改良しました。 同様に、彼らは、明確なネイティブ ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 (CN-PAGE) で固有蛍光を使用して、HR1-HR2 複合体形成を評価しました。

研究者らは、HR2 バリアントと HR1 の間の複合体形成を検出する 2 つのアッセイと、SARS-CoV-2 S の膜融合機能の阻害に対する HR2 の N 末端伸長の影響をテストする細胞間融合アッセイを開発しました。

最初のアッセイでは、大腸菌の細胞表面を使用して、強化された円順列置換 OmpX タンパク質 (eCPX) タンパク質足場に HR2 ペプチドを表示しました。 次に、研究者らはこれらの細胞を、緑色蛍光タンパク質 (GFP) でタグ付けされた HR1 および HR1 に結合する HR2 ペプチドを発現する GFP 陽性細胞とインキュベートし、蛍光活性化細胞 (FAC) ソーティングを使用して選択しました。 2 番目のアッセイでは、メッセンジャー リボ核酸 (mRNA) ディスプレイを使用して、HR2-HR1 複合体形成を検出しました。

調査結果

現在の研究で開発された新規の N 末端拡張 HR2 ペプチドは、すべての主要な SARS-CoV-2 バリアントに対して最大 100 倍強力な阻害を示し、最大阻害濃度の半分 (IC50) の値は、細胞ベースの融合アッセイ。 特に、Omicronバリアントに対して約10倍低い阻害活性がありました。 Omicron の HR1 領域の 3 つの変異 – Q954H、N969K、および L981F – はすべて、HR1 と HR2 の N 末端伸長の間の領域にネストされており、longHR2_42 のより弱い阻害活性を説明しました。

SARS-CoV-2 感染と HR2 ペプチドによる阻害の模式図。 (I) SARS-CoV-2 は、S タンパク質の S1 ドメインとの相互作用を介して宿主細胞受容体 ACE2 に結合します。 (II) 宿主細胞のプロテアーゼによる切断後、S1 ドメインが解放され、S タンパク質の S2 ドメインが宿主細胞膜に伸長します。 (III) わずかに酸性の pH によってトリガーされると、S2 ドメインは折り畳まれてウイルスと宿主細胞膜を近接させ、(IV) HR1 および HR2 ドメインの折り畳みはウイルス膜と宿主細胞膜との融合を触媒します。 (V) longHR2_42 阻害剤の存在下で、S タンパク質は、(VI) 切断後に longHR2_42 阻害剤が HR1 ドメインに結合し、(VII) HR1 ドメインと HR2 ドメインの折り畳みを防止する場合と同様の方法で宿主細胞受容体に関与します。膜融合をブロックします。 このモデルでは、融合をブロックするために、阻害剤の潜在的な結合部位のサブセットのみを占有する必要があります。

Delta VOC に対して、IC50 値は、VSV-SARS-CoV-2 感染アッセイと本物の SARS-CoV-2 感染アッセイの間でほぼ 5 倍の差がありました。

さらに、研究者らは、longHR2_42 は、この研究で説明されている 3 つの結合アッセイすべてで、HR1 に対する見かけの親和性に対応する増加を示さなかったことに注目しました。 同じことには 2 つの説明が考えられます。 まず、これらのアッセイは、親和性のわずかな変化を検出できるほど感度が高くありませんでした。 ただし、他の要因がHR2由来ペプチドの抗SARS-CoV-2有効性に影響を与えた可能性が高い.

単一ウイルスのイメージングにより、SARS-CoV-2 の宿主細胞受容体への融合には 9 ~ 12 個の S タンパク質が必要であることが明らかになりました。 したがって、単一の阻害タンパク質が融合を妨げる可能性があります。 また、S タンパク質の切断には、膜貫通型プロテアーゼ セリン 2 (TMPRSS2) またはカテプシンが必要です。 研究者らは、ウォッシュアウト実験でカテプシンを阻害するためにダイナミン阻害剤 dynasore-OH を追加したため、ペプチド結合のための SARS-CoV-2 S のプレヘアピン中間体が確立されました。 したがって、TMPRSS2 が存在しない場合、ウイルスとペプチドの関連性は弱く、阻害寿命はわずか 15 ~ 20 分に制限されます。 それにもかかわらず、longHR2_42 の観察された増強された親和性は、S 切断に必要な宿主細胞プロテアーゼとは無関係でした。

結論

SARS-CoV-2 S の HR2 ヘリックス領域は、その VOC およびより遠縁のウイルスに対して機能する強力なペプチド由来の抗 SARS-CoV-2 治療薬の供給源になる可能性を示しました。 さらに、longHR2_42 ペプチドは、ウイルス感染アッセイで洗い流されたにもかかわらず、長い阻害寿命 (3 時間以上) を有し、SARS-CoV-2 S タンパク質のプレヘアピン中間体を標的としたことを示唆しています。 実際、この研究データは、SARS-CoV-2 S 糖タンパク質のプレヘアピン中間体をさらに裏付けています。

著者によると、longHR2_42 ペプチド配列を拡張すると、その効力が高まる可能性があります。 さらに、その配列の最適化により、その活性がさらに向上し、他の新規 SARS-CoV-2 バリアント特異的ペプチドを開発するためのプラットフォームが提供される可能性があります。

ジャーナルの参照:

スパイクタンパク質のプレヘアピン中間体を標的とする非修飾ペプチドによる SARS-CoV-2 感染のナノモル阻害。 カイル ヤン、チュチュ ワン、アレックス JB クロイツバーガー、ラヴィ オジャー、スヴィ クイヴァネン、セルジオ クーカーデル、セリーナ ムラチオグル、ティモシー J. アイゼン、K. イアン ホワイト、リチャード G. ヘルド、スブ サブラマニアン、ケンドラ マーカス、リチャード A. プフューツナー、 Luis Esquivies、Catherine A. Doyle、John Kuriyan、Olli Vapalahti、Giuseppe Balistreri、Tom Kirchhausen、Axel T. Brunger、PNAS 2022、DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2210990119、https://www .pnas.org/doi/10.1073/pnas.2210990119



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