6-チオグアニンとして知られる FDA 承認のチオプリンの新しい抗ウイルス作用機序

Study: Thiopurines inhibit coronavirus Spike protein processing and incorporation into progeny virions. Image Credit: Bacsica/Shutterstock


PLoS Pathogens に掲載された最近の研究で、研究者らは 6-チオグアニン (6-TG) として知られる FDA (食品医薬品局) 承認のチオプリンの新しい抗ウイルス作用機序について説明しました。

研究: チオプリンは、コロナウイルス スパイク タンパク質の処理と子孫ビリオンへの取り込みを阻害します。 画像著作権: Bacsica/Shutterstock

バックグラウンド

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) のパンデミックは、効果的で安全な抗ウイルス薬を開発するために薬を転用する取り組みに拍車をかけています。 宿主標的抗ウイルス剤 (HTA) は、宿主の細胞プロセスを阻害したり、抗ウイルス応答を刺激したりすることにより、ウイルスの複製を間接的に阻害します。

本研究の著者らは以前、チオプリン、6-チオグアノシン (6-TGo)、および 6-TG が、アンフォールドタンパク質応答 (UPR) の活性化とウイルス糖タンパク質のプロセシングおよび蓄積の干渉によって IAV (インフルエンザ A ウイルス) の複製を阻害することを実証しました。

研究について

本研究では、6-TG および他のチオプリンがコロナウイルス (CoV) 糖タンパク質に干渉できるかどうかを調査しました。

重度のSARS-CoV-2、ヒトCoV(HCoV)-OC43およびHCoV-229Eの複製阻害とウイルスリボ核酸(RNA)合成の破壊に対するチオプリンの有効性が評価されました。 細胞培養実験は、293T細胞、HCT-8(ヒト回盲腺癌細胞株)、Huh7.5(ヒト肝癌由来細胞株)、初代ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)不死化線維芽細胞、およびCalu-3(肺腺癌細胞株)を使用して実施されました。細胞株)細胞。

さらに、ウイルス粒子の放出は、細胞外ウイルスゲノムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-qPCR) 分析によって評価されました。 抗ヌクレオカプシド (N) 抗体および二本鎖 RNA (dsRNA) について、HCoV-OC43 感染細胞を使用した免疫染色分析を実施しました。 リボピューロマイシン化アッセイを実施し、293T 細胞に N、スパイク (S)、膜 (M)、エンベロープ (E) タンパク質などの SARS-CoV-2 構造タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクトして、SARS に対する 6-TG の影響を評価しました。 -CoV-2構造タンパク質。

さらに、SARS-CoV-2 S は異所的に発現され、複数の 6-TG 濃度に対して評価され、その後、疑似ビリオン (PV) を使用したイムノブロッティング分析が実行されました。 S 発現 293T 細胞ライセートを PNGase F (ペプチド-N-グリコシダーゼ) で処理して、ポリペプチド鎖から N-結合グリカンを除去し、分泌経路に対する 6-TG の効果をガウシア ルシフェラーゼ アッセイで評価しました。

フローサイトメトリー (FC) 分析と S 発現 293T 細胞の表面染色を行って S 分泌を測定し、細胞に EGFP+ (強化緑色蛍光タンパク質) プラスミドを同時トランスフェクトして、S タンパク質蓄積の変化を評価しました。

さらに、SARS-CoV-2 構造タンパク質およびプラスミドを用いた細胞同時トランスフェクションを実施して、組み立ての欠陥メカニズムを解明し、チームは、既知の 6-TG 標的が S タンパク質の成熟欠陥を引き起こすかどうかを判断しました。 チームはまた、透過型電子顕微鏡 (TEM) 分析により、6-TG 治療後の潜在的な HCoV 形態変化を評価しました。

結果

6-TG は、SARS-CoV-2 および HCoV-OC43 複製の初期段階を阻害し、完全長のウイルスゲノム、構造タンパク質、およびサブゲノム RNA の蓄積を制限しました。 異所性 S 発現分析は、S タンパク質からの in vitro 酵素的 N 結合型オリゴ糖除去に従って、6-TG 処理によるいくつかの βCoV からの S タンパク質電気泳動移動度の向上を示しました。 6-TG処理細胞のSARS-CoV-2 VLP(ウイルス様粒子)は、Sタンパク質を欠いていました。

同様の 6-TG 効果が、SARS-CoV-2 S 偽型レンチウイルスの産生で観察され、アンギオテンシン変換酵素 2 (ACE2) 発現細胞に感染できない S 欠損偽ウイルスが得られました。 調査結果は、6-TG 処理が欠陥のある S タンパク質プロセシングと人身売買につながり、それによって感染性子孫ウイルスのアセンブリを妨げることを示しました。 ただし、HPRT1 (ヒポキサンチン ホスホリボシルトランスフェラーゼ 1) による 6-TG のヌクレオチド (nt) 型への変換は抗ウイルス活性に不可欠であり、これはグアノシン-5′-三リン酸 (GTP) アーゼ アゴニストである ML099 によって克服される可能性があります。

GTPアーゼ阻害剤なし [Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1), Ras homolog family member A (RhoA), and Cell division control protein 42 homolog (CDC42)] S 蓄積または処理に影響を与え、6-TG が未知の細胞 GTPase を阻害することによって S 成熟を阻害したことを示しています。 6-TG、6-チオグアノシン (6-TGo)、および 6-メルカプトプリン (6-MP) は、SARS-CoV-2 ビリオン放出を 4 log 減少させ、6-TGo は同等の HCoV-OC43 および HCoV-229E 阻害を示しました。一方、6 MP は効果がありませんでした。 RT-qPCR 分析では、6-TG 処理により、感染初日に HCOV-OC43 力価が 20 倍減少したことが示されました。

推定全長ゲノム ウイルス RNA は、感染のほとんどの段階で 10 倍減少しました。 6-TG 処理により、ウイルスの S および N をコードするサブゲノム RNA が同様に減少し、タンパク質の蓄積が減少しました。 HCoV-OC43感染細胞を抗N抗体で免疫染色すると、最初は点状染色が示され、その後末梢染色が示されました。 6-TG処理後、染色された領域はより明るくなり、感染後24時間(hpi)に大きな斑点が観察されました。 dsRNA の免疫染色では、6-TG 処理細胞で dsRNA シグナルが大幅に減少していました。

6-TG は、UPR 下流の転写応答を遅延または抑制しましたが、HCoV-OC43 感染細胞の翻訳開始率には影響しませんでした。 HCoV-OC43 感染の 6-TG 阻害は、イノシトール要求酵素 1 (IRE1) の活性化と X ボックス結合タンパク質 1 (XBP1s) 標的遺伝子の蓄積を制限しました。 調査結果は、6-TG がウイルスの全長ゲノムおよびサブゲノム RNA 合成を妨害したにもかかわらず、宿主の遮断は乱されなかったことを示しました。

6-TGはSARS-CoV-2構造タンパク質(特にS)の発現を減少させ、イムノブロッティング分析は、S0前駆体タンパク質を表す高分子量のSバンドを示しました。これは、PNGaseF処理にも感受性がありました。 電気泳動移動度分析の結果は、6-TG が S グリコシル化とプロセシングを阻害することを示し、Gaussia ルシフェラーゼ実験は、6-TG が全体的な分泌経路の破壊を引き起こさないことを示しました。 TEM 分析では、6-TG 処理細胞ではウイルス粒子が少ないことが示されました。

結論

全体として、研究結果は潜在的な HTA 標的として小さな GTPase を強調し、異所性発現、本物の HCoV 感染、および PV と VLP の産生などのいくつかのモデルにおける S に対する 6-TG の効果は、パパインのようなものを超えた抗ウイルスメカニズムを示しています。プロテアーゼ (PLpro) 阻害。



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