O結合シアログリカンはSARS-CoV-2スパイク切断に影響を与える

Study: O-Linked Sialoglycans Modulate the Proteolysis of SARS-CoV-2 Spike and Contribute to the Mutational Trajectory in Variants of Concern. Image Credit: NIAID


bioRxiv* プレプリント サーバーに投稿された最近の研究では、スペイン、英国、米国の研究者が化学ツールを使用して、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2 )スパイク(S)加工。

研究: O-結合型シアログリカンは、SARS-CoV-2 スパイクのタンパク質分解を調節し、懸念されるバリアントの変異軌道に寄与します。 画像著作権: NIAID

バックグラウンド

SARS-CoV-2 S は、高密度のグリカン コートを持つ三量体のマルチドメイン糖タンパク質です。 フルレングス S (FL-S) の多塩基性 (アルギニン リッチ ペプチド シーケンス) フリン切断部位 (FCS) は、フリンまたは膜貫通プロテアーゼ セリン 2 (TMPRSS2) によって切断された後、宿主細胞受容体への結合を強化します。 FL-S の S1 および S2 サブユニットへの強化されたタンパク質分解切断は、FCS に先行するアミノ酸 (AA)/ペプチド残基グルタミン (Gln) 675 とプロリン (Pro) 681 間の多型に起因しています。 特に、SARS-CoV-2 S のこのペプチド領域には、N-アセチルガラクトサミン (O-GalNAc) グリカンを運ぶ可能性のある複数のセリン (Ser) およびスレオニン (Thr) AA 残基も含まれています。 著者らによると、Ser/Thr 結合 O-GalNAc グリコシル化は、フリンおよび TRMPSS2 を介した S 切断に影響を与えます。

この AA ストレッチはまた、最も変異しやすい傾向があります。 その後、懸念されるアルファおよびデルタ SARS-CoV-2 バリアント (VOC) では、Pro681 からヒスチジン (His) およびアルギニン (Arg) へのいくつかの変異がそれぞれ含まれています。 BA.1、BA.2、および BA.5 を含むすべての Omicron サブ系統では、P681H および N679K に変異があります。 これらの変異はすべて、S タンパク分解性切断を促進する効果があります。 SARS-CoV-2 S でこのペプチドストレッチを研究することは、その生合成の複雑さとペプチドコンセンサス配列の欠如のため、分析上の課題です。 さらに、グリカンの存在量、それらの結合部位、およびタンパク質分解に対する構造的影響に関するデータが不足しています。 さらに、O-GalNAc グリコシル化に対する SARS-CoV-2 VOC 変異の役割についてはほとんど調査されていません。

さまざまな基質を持つ 20 の GalNAc トランスフェラーゼ、GalNAc-T1 から T20 アイソザイムのファミリーがあります。 各 GalNAc-T のグリコシル化部位を特定説(推定)することで、O-グリカン生物学への洞察が得られる可能性があります。 Ten Hagen らによる以前の研究では、GalNAc を SARS-CoV-2 S に導入できる 7 つのアイソザイムを発見しました。

研究について

本研究では、研究者は「バンプ アンド ホール (BH) エンジニアリング」と呼ばれる化学工学手法を使用して、生細胞内の個々の GalNAc-T イソ酵素を研究しました。 さらに、彼らは、糖ペプチドの断片化ベースのシーケンスを改善することで、質量分析 (MS) ベースの分析を強化できると主張しました。

最初に、研究者らは SARS-CoV-2 野生型 (WT) 株の組換え S を、GalNAc-T1 または T2 の WT または BH バージョンのいずれかを含むヒト Expi293-F 細胞で生成された P681R (または P681H) コンストラクトとインキュベートしました。 次に、これらの構築物をヌクレオチド糖ウリジン二リン酸 (UDP)-GalN6yne でぶつけました。 彼らは、ストレプトアビジンブロットによる可視化のために、銅(I)触媒アジド-アルキン付加環化(CuAAC)によってグリコシル化されたバージョンにタグを付けました。 この処理により、GalN6yne がアイソザイム特異的な方法で導入され、糖ペプチドに追加の正電荷が付与され、MS 分析が容易になりました。

a) SARS-CoV-2 スパイク モデルと漫画。 懸念される COVID-19 バリアントおよび関連するコロナウイルスのフリン切断部位とペプチド アラインメント。 黄色で強調表示されているのは、SARS-CoV-2 の多塩基性モチーフです。太字と赤は、679 位と 681 位のアミノ酸の変化です。b) バンプ アンド ホール エンジニアリングにより、クリック可能な基質UDPGalN6yne。 FCS = フリン切断部位。 VOC = 懸念される亜種。

次に、チームは FL-S および S1/S2 サブユニットをゲル内消化にかけ、タンデム MS (ETD) で分析しました。 彼らは、高強度の衝突誘起解離 (HCD) を使用して、裸のペプチド配列とグリカン組成を取得し、I タグ付き GalN6yne 診断イオンを使用して、ペプチド バックボーンの ETD フラグメンテーションをトリガーしました。 研究者はまた、研究結果を in vitro で検証しました。 この目的のために、彼らは、BH-GalNAc-T1 および BH-GalNAc-T2 の可溶型による組換え発現 S タンパク質のグリコシル化と、I タグ付きアジドおよび MS 糖プロテオーム分析による CuAAC を使用しました。

チームは、合成ペプチドのパネルを使用して、GalNAc-T1 を介したグリコシル化に対する S タンパク質変異の影響を研究しました。 これらのペプチドには、主要なホットスポットである Gln675、Gln677、アスパラギン (Asn) 679、および Pro681 に SARS-CoV-2 VOC 関連の変異がありました。

グリコシル化は、切断部位までの距離とグリカン組成に応じて、S タンパク質分解処理を調節します。 そのため、研究チームは、Thr678 上の O-GalNAc グリカンが合成フェルスター共鳴エネルギー移動 (FRET) 活性基質ペプチドを使用して、フリンによる S 切断を調節するかどうかを直接調べました。 Gln 残基 672 から 689 にまたがるペプチドは、それぞれ蛍光供与体およびクエンチャー部分として、N 末端 2-アミノベンゾイルおよび C 末端 3-ニトロ-Tyr を含んでいました。 蛍光強度の増加は、風鈴を介した S 切断を示しました。 まず、WT (FRET-1) と P681H 変異体スパイク (FRET-2) のいずれかに対応する非グリコシル化基質を比較しました。 さらに、彼らは組換え TMPRSS2 をグリコペプチド FRET 基質 FRET-1、FRET-3、および FRET-7 を FRET-9 に供した。

調査結果

計算および手動検証により、Thr678 は、BH-T1 を発現している細胞のみで、FL-S および S1 サンプルの両方で I タグ付き修飾 GalN6yne を保持していることが明らかになりました。 BH-T1 および BH-T2 グリコシル化スレオニン (Thr) 323 はいずれも GalNAc-T アイソザイムとは関連していませんでした。 FRET分析により、SARS-CoV-2 S糖タンパク質のThr678上のO–GalNAcグリカンの精緻化、特に負に帯電した修飾により、フューリン活性が著しく阻害されることが明らかになりました。 GalNAc-T1 を発現する肺上皮細胞の O-グリカンは、グリコシル化が進化の過程で S タンパク質の成熟を制限する生理学的に重要な修飾であることを示唆しています。

著者によると、O-GalNAc グリコシル化の破壊は、SARS-CoV-2 VOC の進化の背後にある主要な原動力でした。 SARS-CoV-2 アルファからデルタおよびオミクロン VOC への進化の軌跡の中で、FCS に先行する AA 配列の顕著な変化は、VOC 感染性の増加に伴ってタンパク質分解切断が徐々に強化されることを示しました。 伝染性の高い Delta VOC (P681R) に見られる類似の突然変異も、フリン切断の上昇に関連しており、固有のフリン認識を増加させる前に O-グリコシル化を抑制する進化の軌跡を示唆しています。

Alpha などの初期のバリアントで検出された P681H とは対照的に、Omicron の N679K 変異はグリコシル化に実質的な影響を与えませんでしたが、合成ペプチドのフリン切断を強化しました。 これらの FCS 近位変異は相乗的に作用し、進化してグリコシル化を抑制し、フリンの切断を促進しました。

結論

現在の研究では、O-グリコシル化が SARS-CoV-2 S 切断と成熟の重要な決定要因であることが確立されました。 また、ウイルスの進化によって失われた祖先の SARS-CoV-2 株の残骸である可能性もあります。

研究者らは、GalNAc-T1 が生細胞の Thr678 でグリコシル化を促進することを証明しました。 S の Thr678 のグリコシル化部位 (FCS に近くない) は、単一の GalNAc 残基がフリン活性を調節するのに不十分であり、TMPRSS2 活性にわずかに影響を与えるだけである理由を説明しました。 それどころか、精緻化とシアリル化により、風鈴活性が最大 65% 抑制されました。 同様に、O-グリコシル化は TMPRSS2 による S 切断に悪影響を及ぼし、コア 1 (Galβ1-3GalNAc-) 二糖含有 O-グリカンが最も効果的でした。 全体として、この研究結果は、SARS-CoV-2 の進化を研究するためのより高度な糖鎖追跡技術の必要性を強調しています。

*重要なお知らせ

bioRxiv は、査読されていない暫定的な科学レポートを発行しているため、決定的なものと見なしたり、臨床診療/健康関連の行動をガイドしたり、確立された情報として扱ったりするべきではありません。

ジャーナルの参照:

O-Linked Sialoglycans Modulate the proteinlysis of SARS-CoV-2 Spike and contributed in the Mutational Trajectory in Varariant of Concern, Edgar Gonzalez-Rodriguez, Mia Zol-Hanlon, Ganka Bineva-Todd, Andrea Marchesi, Mark Skehel, Keira Mahoney, Chloe Roustan、Annabel Borg、Lucia Di Vagno、Svend Kjaer、Antoni G. Wrobel、Donald J. Benton、Philipp Nawrath、Sabine L. Flitsch、Dhira Joshi、Andres Manuel Gonzalez-Ramirez、Katalin A. Wilkinson、Robert J Wilkinson、Ramon Hurtado -Guerrero、Stacy A Malaker、Benjamin Schumann、bioRxiv プレプリント 2022、DOI: https://doi.org/10.1101/2022.09.15.508093、https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.15.508093v2



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